Каменный храм возведен прихожанами в 1685 году. Прежде на этом месте стояла деревянная церковь в честь Рождества Богородицы с приделом святителя Николая Чудотворца.
С момента образования самостоятельной Калужской епархии и до завершения строительства Троицкого кафедрального собора (то есть с 1799 по 1819 гг.) Никитская церковь выполняла функцию кафедрального собора. Так что во время нашествия Наполеона в 1812 году этот храм стал местом ключевых городских событий.
В 2012 году при храме благоустроили сквер, где установили памятник Петру и Февронии Муромским. В цокольном этаже храма работает Духовно-просветительский центр (ДПЦ), включающий в себя библиотеку, кинолекторий, воскресные школы для детей и взрослых.
В 2021 году в цокольном этаже храма открыли Музей истории Православия на Калужской земле.